1927年4月12日，蒋介石集团在上海发动四一二清党反共事件，国共合作关系开始破裂。4月18日，南京国民政府成立，中国政治局势发生根本变化。南京政府与张作霖为首的北京政府，南北呼应，大肆屠杀共产党员和革命人士，全国各地处于白色恐怖之中。一时之间，黑云压境，血雨腥风，大革命到了危急关头。

在此紧要关头，中国共产党第五次全国代表大会于1927年4月27日至5月9日在武汉举行。但这次大会没有能在生死存亡的危急关头，为革命指明出路。五大选举了中央委员会和中央监察委员会，中央委员会选举了中央政治局，并选举陈独秀、张国焘、蔡和森组成中央政治局常务委员会，陈独秀为总负责人。右倾主义投降路线依然没有改变，这自然难以承担起挽救革命的任务。

中共五大闭幕后，在武汉国民政府辖区内的反共事件接二连三发生，反共活动迅速表面化、公开化。首先发难的是夏斗寅。夏斗寅原为湖南军阀萧耀南手下，北伐军占领湖南后，被迫投降，被任命为国民革命军鄂军第1师师长，参加北伐。攻克武汉后，夏任独立第14师师长，下辖4团1营，共一万三千多人，驻防宜昌。1927年5月13日，夏斗寅发表讨共通电，在宜昌发动兵变，16日进逼武汉，后被第24师师长叶挺所部击败。

影响更为恶劣、后果也更加严重是马日事变。5月21日晚，驻军长沙附近的第三十五军第三十三团，在团长许克祥策划下，1000多名士兵，兵分三组，向长沙城内各革命机关进行突然袭击。至22日上午为止，被捣毁和袭击的革命机构达70多个。大批的共产党员、国民党左派人士和革命群众被杀害，被逮捕及被临时拘押的更多。这就是震惊中外的”马日事变”。接着，湖南各地也发生类似事件，常德、溆浦、湘潭、湘乡、浏阳、衡阳等20余县，先后发生了反共屠杀事件。据统计，马日事变后的半个月中，全省被屠杀的革命群众在1万人以上。湖南的中共党组织遭到严重的打击。

在两湖地区之外，其他各地的反共事件也接连发生。例如，6月6日，江西省政府主席、国民革命军第五方面军总指挥朱培德以”礼送出境”为名，把大批共产党员和国民党左派人士驱逐出江西，并查封革命团体，逮捕工农领袖。

在这种情况下，鲍罗廷和陈独秀等依然把希望寄托在北伐军与冯玉祥所部的会师上。北上的国民革命军经过浴血奋战，以伤亡1.4万多人的代价击溃了奉军在河南的主力，使东出潼关的冯玉祥所部得以在5月31日占领郑州。6月10日至12日，汪精卫等武汉政府领导人在郑州同冯玉祥举行会议，最后决定将河南和西北的军政大权交给冯玉祥，武汉政府的北伐军全部回师武汉。6月20日，冯玉祥与蒋介石在徐州举行会议，此后冯玉祥公开倒向蒋介石阵营，冯致电武汉政府，要求将鲍罗廷解职遣送回国，并将自己所部军队内的共产党员和大批政治工作人员解职。

在革命的危急关头，共产国际执委会通过关于中国问题的决议，并给中共中央发来相应的指示，即”五月指示”。主要内容是：改造国民党使工农分子大批参加进去；把农民协会变成乡村政权；组织七万军队，其中要包括两万共产党员；没收地主土地。莫斯科方面显然不了解瞬息万变的中国革命实际情况。鲍罗廷和中共中央均认为”五月指示”提出的任务难以实行。但是，6月4日，共产国际驻华代表罗易却将”五月指示”给汪精卫看。此举，罗易不但没有取得汪精卫的信任，反而为汪分共提供了一个借口。当日，武汉国民党中央决定解除鲍罗廷的顾问合同。这时，以汪精卫为首的武汉政府的分共意图已经很明显。

6月下旬，汪精卫与谭平山谈话，要求谭与苏兆征立即辞去国民政府部长职务，30日，谭辞职。7月12日，中共中央根据根据共产国际指示进行改组，陈独秀停职，成立由张国焘、周恩来、李维汉、张太雷、李立三组成的中央常务委员会。13日，中共中央指责武汉政府公开的准备政变，宣布退出参加国民政府的共产党员。

7月15日，汪精卫主持召开了武汉国民党中常会第20次扩大会议。出席会议还有孙科、谭延闿、顾孟余、陈公博等人。汪精卫报告了从罗易处读到”五月指示”的经过，汪认为，这个电报有五层意思，都是很厉害的，随便实行哪一条，国民党就完了。他说：”现在不是容共的问题，乃是将国民党变成共产党的问题，国民党的同志想起来，能不痛心！”孙科、顾孟余积极支持汪精卫对共产党加以相当的制裁，于右任、彭泽民婉转表达了不同意见，其他人则沉默不语。会议决定：在一个月内，召开国民党二届四中全会；在开全会之前，中央党部应裁制一切违反本党主义政策的言论行动；遣人赴苏俄，讨论切实联合办法。

7月16日，《汉口民国日报》公布了《保护共产党员个人身体自由的训令》、《保护农工之训令》，以贯彻汪精卫标榜的”和平分共”政策。19日，武汉国民党中央公布了《容共政策之最近经过》，声称：中共中央决定撤回参加国民政府的共产党员”，既然共产党退出国民政府，”便无异脱离本党”，其在国民革命军及各级政府机关中亦无须存在。25日，武汉国民党中央发表《告中国共产党书》，宣称：共产党应即”自憬”，应放弃对国民党的敌视态度，否则就要执行相当的纪律。同日，国民党中央训令各省党部、政府、军部，应对共产党人的活动”严加防范”。

8月1日，中共在南昌发动武装起义。随后，武汉政府开始搜捕、屠杀共产党人、革命人士和工农群众。至此，国共合作关系彻底破裂了，轰轰烈烈的大革命宣告失败。